凌波微课|微生态群落中单个物种的绝对定量？

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群落中单个物种的绝对定量

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同学们大家好，学生信，做分析就上凌波微课，欢迎大家扫描二维码关注凌波微课，加入凌波微课交流群参与我们的课程和课下交流，我是主讲人线条姐，今天我们给大家分享的内容是微生态研究中，单个物种如何进行绝对定量？

这个问题也是许多微生态研究的老师关注的问题，16S扩增子测序可以获得细菌类群的相对丰度，但很多情况下解释样本的微生态、状态及功能则需要绝对丰度的加持，除了QPCR这种传统的定量手段外，还有没有什么别的方法可以更快捷地实现单个物种的绝对定量呢？

其实在微生态的研究中，无论是医口还是农口，都存在类似的问题。微生物的医学研究中，很多疾病的严重程度和治疗反应最直接的体现者实际上是单一病原体的绝对丰度，农业研究中也报道了基于相对丰度的研究结果，很难与作物生态生理指标进行联系。然而，QPCR技术虽然可以用于各种物种的绝对定量，但针对不同样本中的每一种菌都开发一套QPCR的检测方法，他是不现实的。

图1 在微生态的定量研究

我的好友M君在慢慢的科研路上也遇见了相同的问题。有一天他灵机一动，冒出一个想法：既然16S扩增子可以得到每种菌的相对丰度，用16S通用引物进行QPCR就可以获得样本中所有物种的绝对丰度。那么，理论上用总菌群的绝对丰度乘以单个物种相对丰度，不就应该是单个物种的绝对风度吗？如此一来，这个问题岂不迎刃而解！

图2 M君的困惑

那么能还是不能呢？2020年来自华盛顿大学的学者们在mSystem上，就这个解决方案是否靠谱进行了详细的探讨。研究中，20名患有细菌性生殖道疾病的女性患者连续60天采集生殖道拭子样本，共获得1320例样本，开展扩增子测序和总细菌的QPCR定量，并利用乘积的方式推断每一种菌的绝对丰度，在此基础上，研究者对其中的七种菌进行了QPCR的定量，用于比较评估实际定量结果与推断定量结果的一致性。接下来，我们就来看看这个研究带给我们哪些启示。

研究首先针对其中一个志愿者的样本进行分析，a图展示的是分别对七种特定菌种在连续60天取样的过程中，进行QPCR绝对定量的结果，开展七个物种绝对丰度的变化趋势讨论；同时，b图中针对所有样本进行16S测序，获取连续60天内相对丰度的变化趋势；然后结合单菌相对丰度乘以总菌群绝对定量的方法得到c图，为对应单均连续60天的推断绝对丰度。从中不难看出，单一物种的变化用QPCR检测与扩增子检测结果是有区别的，如红色框标记的细菌（A. vaginae）绝对丰度在415h处突然增加，但是相对丰度直到671h才显示出突然增加；受试者在研究前七天接受了抗生素的治疗，QPCR显示细菌性阴道炎相关物种的绝对丰度呈指数型下降。

然而，扩增子测序则显示，受试者经过治疗更迅速地向Lactobacillus iners转化。另外，扩增子测序的相对丰度也无法捕获细菌的低水平定植，例如扩增子测序在第6至11天（150h和261h）不能发现Gardnerella vaginalis的定殖，而靶向qPCR则可以发现Gardnerella vaginalis的定殖。如前所述，高多样性状态通常与Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, BVAB2, Megasphaera的高绝对丰度同时出现，这些都与细菌性阴道炎（BV）相关。这些结果表明，靶向qPCR为测量单个物种的动力学提供了更精准的评价，而扩增子测序是估计高多样性群落中细菌多样性的最佳方法。

图3 参与者生殖道生态位的复杂细菌动力学

然后，研究将推断值与7个关键物种靶向QPCR所测量的绝对丰度进行了比较。对于每个物种，在大多数样本中推断出的细菌绝对丰度，与QPCR所测量的绝对丰度很类似。但由于细菌总量的变化，相对丰度的估计可能会歪曲实际丰度。如图显示，两个样本中两个物种动态变化，不难看出在箭头指示的某些时间点，绝对丰度和相对丰度会显示出不同的甚至相反的变化趋势，这通常是由于总细菌含量和单个菌的相对丰度发生了较大变化，例如b图中实线为实测的绝对丰度，灰色线为细菌总量，曲线为推测丰度，推断的细菌绝对丰度始终高于QPCR做测量的绝对丰度。针对七个临床关键物种的研究发现，利用这样的方式推断的绝对丰度值对大多数样本都是准确的，但当样本的相对丰度较低时，这种推断的绝对丰度值很容易出错。

图4  由于细菌总负荷的变化，相对丰度估计可能会歪曲实际丰度。两名受试者中两种不同物种的物种特异性特征的示例。

那么，相对丰度和推断的绝对丰度，谁更靠近样本中绝对丰度的真实情况呢？研究者通过计算Spearman相关系数，挖掘了三者间的关系。通过计算相对丰度与QPCR实测的绝对丰度，以及推断的绝对丰度与实测的绝对丰度之间的相关系数，两种相关系数在统计上没有显著的差异。但与相对丰度相比，推断的绝对丰度与QPCR实测的绝对丰度的相关性略有改善。

图5 与相对丰度相比，推断的绝对丰度与qPCR所测量的绝对丰度的相关性略有改善。（a）绝对浓度与相对丰度的散点图。（b）绝对浓度与推断的绝对丰度的散点图。

同时，研究中留意到不同物种中两种相关系数的排布，从表一不难看出，绝对丰度与推断绝对丰度的相关系数中，红框物种和相关性系数是最高的。

我们定义推断的绝对丰度误差为IC error，算法如下，其中IC是推断的绝对丰度，AC是绝对丰度。

A图显示为IC error的箱式图，可以看出，IC error的范围虽然很大，但是平均值和标准偏差较低，大多数物种中IC error中位数接近，说明推断的绝对丰度误差总体上很少；但其中红框标注的两个物种IC error都小于零，这意味着推断的绝对丰度高估了其真实的绝对丰度，蓝框中的物种则有可能低估了其绝对丰度。B图中则直观展现了相对丰度大于0.5的推断绝对丰度误差条形图统计，横轴是物种的相对含量，不难看出菌种的相对丰度越低，推断绝对丰度的IC error的范围越高，同时针对QPCR检测的绝对丰度值，研究发现推断绝对丰度的误差通常也发生在较低的细菌总含量条件下。

图6 与绝对丰度相比，较低的细菌相对丰度是推断的绝对丰度误差的主要预测因子。

此外，推断的绝对丰度与测序深度或样本多样性是否有关呢？低细菌相对丰度是推断绝对丰度误差的主要来源，但从这几张图可以看出，Shannon指数、样本多样性以及测序深度等都与之无关，在所有原始物种计数相关中均观察到> 0.5的推断绝对丰度误差，但最大的误差（> 2）几乎完全与100以下的原始物种计数相关。

图7 样品多样性，测序深度和物种计数不影响推断的绝对丰度（IC）误差

接下来，通过确定一天中细菌水平的变化来检查推断的绝对丰度是否是评估单个物种动力学的有用工具。相对丰度的变化率与QPCR检测的绝对丰度的变化率之间的相关性很弱，例如在23.2%的时间里，我们观察到相对丰度的变化与绝对丰度的变化相反（见图8a的左上和右下象限），这种类型的错误通常发生在最丰富的物种(e.g., L. crispatus)和较稀有的物种（例如BVAB2）。推断的绝对丰度的变化率（rIC）与QPCR检测的绝对丰度的变化率则显示出更好的相关性，例如推断的绝对丰度将rIC误差（推断的绝对丰度引起的变化率误差）降低了50％以上（从23.2降低到7.97％，图8b）。

图8推断的绝对丰度允许对两个连续样品之间的动力学变化进行某种程度的准确推断。

此外，研究还针对单个受试者中某种菌（绿色框提示）的物种的绝对丰度及推断绝对丰度随时间变化的变化及变化速率开展研究。发现了两种常见的推断丰度变化率误差类型，分别为两个连续点之一或两者的推断绝对丰度为零，这两类误差通常发生在当细菌早期从低丰度增值到后期收缩到低丰度的过程中，这两种推断绝对丰度引起的变化率误差占到了大于0.05的误差的91.7%。如果所有涉及零值的数据都从分析中消除，我们发现推断的绝对丰度的变化率与QPCR检测的绝对丰度变化率之间存在良好的相关性，因此，当细菌丰度较低或使用不太灵敏的16S通用引物进行PCR和NGS无法检测到时，推断的绝对丰度在微生物早期生长或后期收缩不能捕获准确的动力学。然而，当细菌以较高的丰度存在时，推断的绝对丰度可用于估计单个物种的生长率和收缩速率。

图9推断的绝对丰度可以准确推断两个连续非阴性样品之间的动力学变化

综上，当一个物种的相对丰度>10%时，基于QPCR绝对定量的细菌总丰度乘以16S扩增技术获得的单菌相对丰度，推断单种细菌绝对丰度是可以替代靶向QPCR的检 测结果的。当然了，针对相对丰度较低的细菌研究，有针对性地开展靶向QPCR依旧是第一选择。

今天的分享就到这里，玩儿转科研，就来凌波微课！我们下期再见。

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